高效液相色譜 (HPLC) ：原理、類型、組成和應用
高效液相色譜（簡稱 HPLC）是一種用途廣泛、分析能力極強的色譜技術，在藥物生產和研究的許多方面都有應用。它根據物質的分子結構和成分，將混合物分離或識別為不同的成分。
引言
HPLC 應用最廣泛的分離技術。它非常靈敏、特異和精確。
它是柱層析的一種特殊形式，用于生物化學和分析，以分離、鑒定和量化混合物中的活性化合物。
在 HPLC 上有填料（固定相），泵使流動相通過色譜柱，檢測器顯示分析物的保留時間。
保留時間是可變的，主要取決于固定相、分析物和所用溶劑之間的相互作用。
少量待分析樣品被引入流動相流，并通過與固定相的特定化學或物理相互作用而被保留
保留取決于分析物的性質以及固定相和流動相的成分。
高效液相色譜法（HPLC）最常用的有機溶劑是甲醇和乙腈。
組成
原理
高效液相色譜儀（HPLC）是一種以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有顆粒極細的高效固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測的儀器。其原理為色譜法的分離原理，即溶于流動相的各組分經過固定相時，由于與固定相發(fā)生作用的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。高效液相色譜法（HPLC）是將少量液體樣品注入裝有微小顆粒（直徑為 3 ~5 um，稱為固定相）的柱子中，樣品中的單個成分隨著通過泵輸送的高壓液體（流動相）通過色譜柱進入裝有顆粒的柱子。柱填料用于將成分相互分離。這涉及到其分子與填料顆粒之間的各種化學和/或物理相互作用。分離出來的成分會在色譜柱出口處被檢測器檢測到，檢測器會測量這些成分的含量。檢測器的輸出稱為 "液相色譜圖"。
與低壓柱液相色譜法相比的優(yōu)勢
與傳統(tǒng)的低壓柱液相色譜法相比，高效液相色譜法（HPLC）有許多優(yōu)勢。
· 靈敏度更高（可使用各種檢測器）
· 更高的分辨率
· 速度更快
· 便于樣品回收（移除的流動相更少）
· 多種固定相可適用
圖 2.描述色譜法的分支。
類型
HPLC 的以下變體取決于工藝中的相系統(tǒng)（固定相）。
(1)正相高效液相色譜法
又稱正相色譜法或吸收色譜法。這種方法根據極性分離分析物。它有一個極性固定相和非極性流動相。因此，固定相通常為二氧化硅，典型的流動相為正己烷、二氯甲烷、氯仿、二乙醚和混合物。該技術適用于對水敏感的化合物、幾何異構體、順反異構體、類別分離和手性化合物。
(2)反相高效液相色譜法
固定相為非極性（疏水性），流動相為水性、中等極性。它的工作原理是疏水相互作用，因此材料的非極性越強，保留時間就越長。這種技術適用于非極性、極性、可電離和離子分子。
(3)體積排阻高效液相色譜法
又稱凝膠滲透色譜法或凝膠過濾色譜法。色譜柱中填充有精確控制孔徑的材料，顆粒根據分子大小被分離。較大的分子迅速通過色譜柱；較小的分子則穿過多孔填料顆粒，隨后洗脫出來。體積法還有助于確定蛋白質和氨基酸的三級和四級結構。它還可用于測定多糖的分子量。
(4)離子交換高效液相色譜
在這種色譜法中，保留是基于溶質離子與固定相上的帶電位點之間的吸引力。帶相同電荷的離子會被排除在外。這種技術可用于純化水、蛋白質的配體和離子交換色譜、碳水化合物和低聚糖的高 pH 陰離子交換色譜等。
(5)生物親和高效液相色譜
在這類色譜中，分離是基于蛋白質與配體的可逆相互作用。
系統(tǒng)的核心是進行色譜分離。儀器有以下幾個模塊組成：
（1）溶劑儲液器：玻璃儲液器中含有流動相內容物。高效液相色譜法中的流動相或溶劑通常是極性和非極性液體成分的混合物，其各自的濃度根據樣品的成分而變化。
（2）泵：泵將流動相從溶劑儲液器中吸出，并迫使其通過系統(tǒng)的色譜柱和檢測器。根據色譜柱的尺寸、固定相的粒度、流速和流動相的成分等因素，工作壓力最高可達 42000 kPa（約 6000 psi）。
（3）樣品進樣器：進樣器可以是單次進樣，也可以是自動進樣系統(tǒng)。用于高效液相色譜系統(tǒng)的進樣器應能在高壓（高達 40Mpa）條件下對體積在 0.1-100 uL 范圍內的液體樣品進行進樣，并具有較高的重現(xiàn)性。
（4）色譜柱：色譜柱通常由拋光不銹鋼制成，長度在 50 至 300 毫米之間，內徑在 2 至 5 毫米之間。色譜柱通常填充粒徑為 3-10 微米的固定相。內徑小于 2 毫米的色譜柱通常稱為微孔色譜柱。正常情況下，流動相和色譜柱的溫度在分析過程中應當保持恒定。
（5）檢測器：高效液相色譜檢測器位于色譜柱的末端，在分析物從色譜柱洗脫出來時對其進行檢測。常用的檢測器有紫外光譜檢測器、熒光檢測器、質譜檢測器、示差檢測器、電化學檢測器。
（6）數據收集裝置：檢測器發(fā)出的信號可收集到圖表記錄器或電子積分器上，它們的復雜程度和處理、存儲和再處理色譜數據的能力各不相同。計算機將檢測器對每種成分的響應進行整合，并將其放入色譜儀中，以便于讀取和解釋。
應用
高效液相色譜法可獲得的信息包括化合物的分辨、鑒定和定量。它還有助于化學分離和純化。高效液相色譜的其他應用包括
· 制藥應用：控制藥物穩(wěn)定性。藥物劑型的片劑溶出度研究。藥品質量控制
· 環(huán)境應用：檢測飲用水中的酚類化合物。污染物的生物監(jiān)測。
· 法醫(yī)學應用：生物樣本中的藥物定量。鑒定血液、尿液等中的類固醇。紡織品染料的法醫(yī)分析。測定血液、尿液等中的可卡因和其他濫用藥物。
· 食品和香料：軟飲料和水的質量測定。果汁中的糖分分析 蔬菜中多環(huán)化合物的分析。防腐劑分析。
· 在臨床檢驗中的應用：尿液分析、血液中的抗生素分析。肝臟疾病中膽紅素和膽綠素的分析。檢測腦細胞外液中的內源性神經肽等。
